第一節(jié) 采樣方法

水樣可以取自任何有可能生長所需單胞藻的水體，通常在海岸邊退潮后留下的小水洼中或者在養(yǎng)殖場、鹽場等地方的小水坑中，生長有適合靜水培養(yǎng)的單胞藻類，而且比較純。在實驗場、育苗場的一些水池、水桶中都有可能出現(xiàn)比較純的藻類。采樣時要同時測定水樣的溫度和鹽度，供分離、培養(yǎng)時參考。

水樣采回后，進行現(xiàn)微鏡檢查，如果需要分離的藻類比較多，可以立即進行分離。如果在水樣中有需要的藻類，但是數(shù)量不多，就要進行預(yù)培養(yǎng)，待其繁殖起來后再分離。預(yù)培養(yǎng)可以用500ml的三角燒瓶，加入150ml的培養(yǎng)液，然后把經(jīng)350目篩絹過濾的水樣150ml接種進去，在一定的溫度和光照下靜止培養(yǎng)，每天搖動1~2次。用作預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液，可選擇各類藻類通用的培養(yǎng)液配方或者同時采用幾種不同藻類的培養(yǎng)液同時分別培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液的濃度應(yīng)小些，一般只用原配方的1/2或1/4。如果要分離的藻類的最適生長條件是已知的，那就在其最適的光照和溫度下培養(yǎng)。如果不知其最適生長條件，那就在人為設(shè)定的條件下培養(yǎng)，以便適應(yīng)應(yīng)用時的特定環(huán)境。

第二節(jié) 分離方法

一、微吸管分離法

用直徑0.5厘米、長35厘米的普通玻璃管，在中央部分加熱，拉長6~10厘米，使玻璃管的直徑縮小至0.06~0.1厘米，把它折斷后即成二個吸管。把一團棉絮塞進吸管的寬大一端，然后放入高壓滅菌器中消毒。消毒后，再在酒精燈上加熱吸管的細端，用鑷子拉成極細的微管，直徑縮小至0.08~0.16毫米即可。微吸管在入水的瞬間，因毛細管的作用會吸入微量的水。將藻液水樣放在凹玻片上，在顯微鏡下用微吸管仔細地吸出單個藻體，滴在載玻片上，在顯微鏡下確認是所要分離的單個藻體后，移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

二、平板分離法

按所要分離的藻類的特性，選用合適的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入1~1.5%的瓊脂，加熱將瓊脂溶化。加熱后要加淡水補充蒸發(fā)掉的水分。然后，按照微生物學(xué)中固體培養(yǎng)基的制作方法倒平板、滅菌。

在無菌操作箱中，用接種針蘸取少量藻液，在固體培養(yǎng)基上劃蛇形線，藻細胞就會散布在瓊脂培養(yǎng)基的表面。

另一種使藻細胞散布在培養(yǎng)基表面的方法是用醫(yī)用口腔噴霧器，將經(jīng)稀釋的藻液噴在培養(yǎng)基的表面。

將接種好的培養(yǎng)皿放在有適合的光照和溫度的地方培養(yǎng)。一般經(jīng)過十來天的培養(yǎng)就會在培養(yǎng)基上長出相互間隔的藻落。通過顯微鏡檢查，找出所要的純的藻落，再用已消毒的接種針從培養(yǎng)基上挑取藻體，移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

三、水滴分離法

先將欲分離的藻液稀釋，用微吸管將少量藻液吸出，滴在載玻片上，每張載玻片上可以滴數(shù)滴。水滴大小以在低倍顯微鏡下一個視野能包括整個水滴為準。在顯微鏡下逐個觀察水樣，挑選水滴中只有所要分離的單個藻體，而沒有其他任何雜藻或小動物的，移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

四、稀釋分離法

用已消毒的試管5支，在第一支試管中加蒸餾水10毫升，第二和第五支試管都加5毫升，用高壓蒸汽消毒，待冷卻后，在第一支試管中滴入混合藻液1滴，充分震蕩，使其均勻稀釋。再用經(jīng)消毒的吸管從第一支吸管中吸取5毫升到第二支吸管中，充分震蕩后再取5毫升到第三支試管中，如此直至第五個試管。再取5個已裝有消毒的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，加熱使培養(yǎng)基熔化，待冷卻而尚未凝固時，分別滴入5個試管中的藻液各1滴，用力震蕩，使藻液充分混入培養(yǎng)基中。等冷凝后將培養(yǎng)皿放在適合的條件下，直到培養(yǎng)基中出現(xiàn)藻落。在稀釋適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿內(nèi)，藻落和細菌群落會充分分離。再在無菌條件下將選取單個藻落接種到固體培養(yǎng)基的表面，再培養(yǎng)。重復(fù)數(shù)次，直至得到純的藻落。

第二章 藻種的保存技術(shù)

保存藻種時可以根據(jù)保種目的和保種條件的不同分別采取不同的保種方法。

第一節(jié) 固體培養(yǎng)基保存法

此法通常把藻種接種在固體培養(yǎng)基上，在弱光低溫條件下保存，接種一次可以保存半年到一年。

保種用的固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)濃度應(yīng)比正常的液體培養(yǎng)液的高，一般增加一倍。瓊脂量為1~1.5%。保種用的培養(yǎng)容器可用三角燒瓶、試管和克氏扁瓶。固體培養(yǎng)基分裝滅菌后，冷卻待用。

將無污染的藻種用噴霧法或劃線法接種到固體培養(yǎng)基上，在弱光條件下，讓細胞在培養(yǎng)基上慢慢地生長繁殖，可保存半年到一年。

可進行低溫保存的藻種，最好在低溫環(huán)境中保存。接種后，首先放在光線充足的地方（防止直射光照射），使藻類細胞較快速地繁殖起來，直到培養(yǎng)基上出現(xiàn)顏色，即可放入冰箱或冷庫中，一般在5℃左右的低溫下保存。當(dāng)然，不同的藻種保存的溫度也不盡相同。每天應(yīng)給藻種幾個小時的弱光照。此法保存的時間可長達2至3年。如新月菱形藻可保存34個月，三角褐指藻可保存25個月，角毛藻和骨條藻可保存9個月。

第二節(jié)循環(huán)移養(yǎng)保存法

此法采用的容器一般為三角燒瓶（300毫升、500毫升、1000毫升等）和細口瓶（10000毫升、20000毫升等），將容器、工具消毒后，加入正常濃度的培養(yǎng)液，接種后瓶口用消毒的濾紙包扎，放在適宜的溫度和光照條件下培養(yǎng)。白天搖動瓶子數(shù)次。一般5~10天即可移樣一次。此法簡單、容易掌握，而且保存的藻種活力強、純度高、數(shù)量大。

資源來自：中國科學(xué)院海洋研究所海洋生物種質(zhì)庫

上海光語生物科技有限公司提供的光生物反應(yīng)器可以用來實驗室培養(yǎng)藻類。

一、目的

學(xué)習(xí)藻類的分離和培養(yǎng)方法

二、藥品、材料和用具

水生生物培養(yǎng)槽，玻璃片（面積稍大于培養(yǎng)槽），橡皮管，顯微鏡，三角燒瓶，試管，篩絹，棉塞，微吸管，凹玻片，滅菌鍋，載玻片，吸管，培養(yǎng)皿，人工光源，木盆（或小型實驗池），充二氧化碳氣鋼瓶，抽氣泵，離心機。

土壤抽出液，青霉素，鏈霉素，瓊脂，硝酸鈣，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，過磷酸鈣，硫酸鎂，氯化鉀，碳酸鈉，三氯化鐵，硅酸鈉，葡萄糖，蛋白胨，硫酸銨，硝酸銨，氯化鈣，碳酸氫鈉，鉬酸，氯化鈉，檸檬酸鐵，硫酸錳，人尿，海泥抽出液，食鹽。

三、操作

生長在靜水或水流緩慢河流中的藻類，培養(yǎng)比較容易。取到實驗室后，要立刻從材料瓶中移到寬大的水生生物培養(yǎng)槽內(nèi)。為了培養(yǎng)大的絲狀藻，要利用寬的、不高的容器。這些容器要用玻片蓋住，以防止培養(yǎng)物受灰塵沾污。倒入容器的水要達到容器高度的一半，或稍多些，使水面上還有充分空氣。在容器邊緣，要用一小塊縱切橡皮管墊住，可使玻片不致緊貼容器，空氣才能進入容器中。細微的藻類如團藻目、硅藻門能很好地生活于培養(yǎng)皿中。很多藻類如顫藻屬、水綿屬的若干種、輪藻屬等可在實驗室中保存很多年。

在迅速流動水中生長的藻如絲藻屬、毛枝藻屬等比較難于培養(yǎng)，因為它們要求經(jīng)常輸入氧氣。在水層較高水中，在高容器中，這些藻類迅速地死亡。為了把這些藻類保存到實驗時，應(yīng)當(dāng)把它們分成一些小部分，放在水層較薄的、寬的容器內(nèi)，并須常常換水，把空氣吹入水中。還可以用橡皮管把水生生物培養(yǎng)槽和水龍頭連結(jié)起來，建立有流水的水生生物培養(yǎng)槽。

在水生生物培養(yǎng)槽中培養(yǎng)藻類時，應(yīng)盡可能創(chuàng)造和保持藻類天然生存條件。把藻類培養(yǎng)在從采集藻類那一水域取來的水中，或其他天然水（尤其不能用自來水，因其中含很多氯氣，必要的話，也須置較長時間，或加以煮開），或在水中加入混合養(yǎng)料，這些養(yǎng)料是由制造有機物質(zhì)所必需的礦質(zhì)鹽構(gòu)成。

在夏季，不要把藻類培養(yǎng)物放在直射太陽光下，而要放在涼爽的場所，例如向北窗臺上。在秋、冬季節(jié)，如希望藻類保持積極生活活動狀態(tài)，就要把培養(yǎng)物移到有人工光照處。

以上是一般藻類粗放的培養(yǎng)、保存方法。如要作較深入實驗，需注意以下問題：

1．藻種的分離

藻類培養(yǎng)首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類個體分離出來，而獲純種培養(yǎng)。這種方法稱為藻種分離和純化，又稱純培養(yǎng)法。

真正的“純種培養(yǎng)”是指在排除包括細菌在內(nèi)的一切生物的條件下進行的培養(yǎng)。這是進行科學(xué)研究不可缺少的技術(shù)，而在生產(chǎn)性培養(yǎng)中不排除細菌的稱之為“單種培養(yǎng)”。

（1）采樣和預(yù)備培養(yǎng)：首先要采集有需要分離藻類的水樣，采回后在顯微鏡下檢查。如發(fā)現(xiàn)需要分離的藻類數(shù)量較多時，可立即分離。若數(shù)量很少，最好先進行預(yù)備培養(yǎng)，待其增多后，再分離。

用作預(yù)備培養(yǎng)的培養(yǎng)液，各種藻類是不同的，對一些難以培養(yǎng)的藻類一般加入土壤抽出液較好。預(yù)備培養(yǎng)液營養(yǎng)成分濃度應(yīng)小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水樣中藻類種類較多，就應(yīng)使用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類在適合于自己繁殖的培養(yǎng)液中繁殖起來。

可用三角燒瓶或試管作培養(yǎng)容器，加入容量1/4～1/3培養(yǎng)液。然后把經(jīng)篩絹過濾除去大型浮游生物的水樣接種進去，放在合適溫度下或室內(nèi)靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類時，容器可靜止不動；而培養(yǎng)浮游藻類時，應(yīng)該每天搖動一次。

有的藻類在普通培養(yǎng)液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。此時需改變培養(yǎng)液濃度，加入葡萄糖、蛋白胨等有機物，補充微量元素和輔助生長物質(zhì)，加入土壤抽出液，就有可能獲較好效果。

土壤抽出液制作方法：先在試管底部，加入高約1cm土壤（采用腐殖化的農(nóng)田和庭院土）。再加入水使達5cm，塞上棉塞，采用蒸氣間隙滅菌，每天滅菌1小時，連續(xù)二天。由于氣泡上升，棉塞可能弄臟。因此，最好先在水中煮一段時間，使氣泡跑掉后，再加棉塞進行滅菌。

（2）分離方法：常用下列四種。

1）微吸管（毛細管）分離?選直徑較細（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時，快速拉成口徑極細的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認真仔細地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達到純分離的目的。如不成功，應(yīng)反復(fù)幾次，直至達到分離目的為止。然后移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個培養(yǎng)皿中接20～30個個體。從分離出少量細胞擴大培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長時期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（1000～5000單位或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純藻種。

此法操作技術(shù)要求高，要細心。往往吸取一個細胞，要反復(fù)幾次才能成功，且適于分離個體較大藻類。

2）水滴分離法?用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴到消毒過載片上，水滴盡可能滴小些，要求在低倍鏡視野中能看到水滴全部或大部分。一個載片上滴2～4滴，間隔一定距離，作直線排列。如一滴水中只有幾個所需同種藻類個體，無其他生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液，把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)滅菌試管或小三角瓶中去。如未成功，需反復(fù)重做，直到達到目的。

此法簡便易行，尤其適宜于分離已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢種類。分離受少量生物污染培養(yǎng)液中的藻類多用此法。操作時同樣要求細致、認真，使用工具及培養(yǎng)液經(jīng)嚴格消毒。

3）稀釋分離法?把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過稀釋到適宜程度的方法，達到把原混雜生物單個分離培養(yǎng)的目的。

首先把水樣稀釋到每一滴含有一個左右的生物細胞（也可能一個都沒有，也可能有兩個），在稀釋過程中配合顯微鏡檢查，調(diào)節(jié)稀釋度，然后準備裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管20支，每一試管加入稀釋適宜水樣一滴，搖勻，進行培養(yǎng)。待藻類生長繁殖達一定濃度時，再檢查是否達到分離目的，若未達到，再重復(fù)做。

此法操作簡單易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分離法效果好。

4）平板分離法?這個方法的培養(yǎng)基制備和分離方法，與菌類的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過的小型噴霧器中（可使用醫(yī)用喉頭噴霧器），打開培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。

接種后，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養(yǎng)。一般經(jīng)過十余天，就可在培養(yǎng)基上發(fā)生互相隔離的藻類群落，通過顯微鏡檢查，尋找需要的純藻群落，然后用消毒過的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞子，進行培養(yǎng)。

此法較繁，但難度不大，而且可看到是否污染雜菌，對于分離已污染雜菌培養(yǎng)液的藻類更合適。

5）底棲藻的分離?在顯微鏡或放大鏡下挑取個體，一般可接種在固體培養(yǎng)基平板上，反復(fù)挑選、培養(yǎng)。

6）分離浮游藍藻?可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分離硅藻則可利用其易沉淀的特性。

用以上各種方法分離到藻種，需放在適宜光照條件下（靠南或北窗口附近光線充足處，但嚴防陽光直射）培養(yǎng)，有條件的可控制溫度和利用人工光源。培養(yǎng)時，每天輕輕搖動1～2次，但需注意勿把培養(yǎng)液沾濕棉塞，避免雜菌污染。經(jīng)一段時間后，培養(yǎng)物顏色逐漸變深。再經(jīng)一次顯微鏡檢查，如無其他混雜生物，才達到單種培養(yǎng)目的。

2．藻種的培養(yǎng)

獲得單種培養(yǎng)后，一方面擴大培養(yǎng)，另一方面可把藻種作較長時間保存，需要時隨時取出使用。藻種培養(yǎng)要求比較嚴格，培養(yǎng)容器可用各種不同大小的三角燒瓶，容量有100、300、500、1000毫升，適于逐漸擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)容器和工具需經(jīng)煮沸滅菌或使用化學(xué)藥品滅菌后，用煮沸水沖洗，培養(yǎng)液用加熱滅菌法滅菌。按種后瓶口用滅菌紙包扎，放在適宜光、溫條件下培養(yǎng)，每天輕輕搖動二次。大約二周后進行一次移植。藻種在培養(yǎng)過程中必須定期用顯微鏡檢查，保持不受其他生物污染。

3．藻種的保藏

可接在固體培養(yǎng)基上，在常溫、弱光下保藏半年到一年；也可在低溫下（冰箱內(nèi)）保藏，每天接受短時間（幾個小時）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏幾個月。保藏藻種所用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分濃度應(yīng)比正常培養(yǎng)基高一些，一般可增加一倍，瓊脂量為1～1.5％。也可在固體培養(yǎng)基上，再加培養(yǎng)液，然后接種到培養(yǎng)液中，可以避免固體培養(yǎng)基干涸，保藏效果比單用固體好。

4．培養(yǎng)液和培養(yǎng)基的配方

配方極多，每種配方主要適用于一定藻種，這里介紹比較常用的幾種：

水生4號和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍藻可用朱氏10號或水生105號無氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍藻）；硅藻可用朱氏10號和水生硅1號培養(yǎng)基；另外還有海產(chǎn)綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基配方見表1。

以上用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內(nèi)加入1.5％瓊脂。

從以上各種配方，可看到配制藻類培養(yǎng)液的幾條原則：

（1）要有適量氮源（除固氮藍藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機氮等。

（2）應(yīng)包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等。

（3）要考慮各種鹽類總濃度和pH是否適合藻類需要，可用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH。

（4）要加入各種藻類需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）。

（5）要滿足某些藻類特殊需要，如藍藻需鉬，硅藻需硅。

（6）要添加適量生長物質(zhì)如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。

5．大量培養(yǎng)過程

包拈接種、培養(yǎng)、采收等。

（1）接種：一般要求選取生活力強、生長旺盛藻種?？上葘饪s藻種用連續(xù)稀釋法，制備一定濃度的懸浮藻液，然后接入培養(yǎng)容器。接種時注意藻種和培養(yǎng)液比例要適當(dāng)，使藻細胞在新培養(yǎng)液中達到一定數(shù)量。使一開始培養(yǎng)，藻類在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢，另一方面還可縮短培養(yǎng)周期，這是培養(yǎng)得到成功的經(jīng)驗之一。在環(huán)境條件不很適合情況下，更需提高接種量。一般所用藻種濃度，根據(jù)藻類體積大小，每毫升30萬～300萬個，采用1∶2～1∶5的比例。還需注意接種時間，在自然光條件下，最好在上午8～10時，不宜在晚上。尤其是能運動種類，此時明顯向上浮游，接種時可把上浮優(yōu)質(zhì)藻類吸出做藻種，起選種作用。

（2）培養(yǎng)管理：主要是使已接種培養(yǎng)物在相對穩(wěn)定適宜環(huán)境中大量繁殖生長。要注意以下因素：

1）二氧化碳濃度在開放式不通氣方法培養(yǎng)中，攪拌是十分必要的，可以增加水和空氣的接觸面，使空氣中二氧化碳溶解到培養(yǎng)液中，而且?guī)椭恋碓孱惣毎细～@得光照。在通氣培養(yǎng)中，培養(yǎng)液內(nèi)應(yīng)維持二氧化碳濃度在0.1～5％之間。

2）光照強度?利用太陽光源培養(yǎng)時，一般在室內(nèi)培養(yǎng)可放在近窗口地方，防止強直射光照射?；蚶萌斯す庠矗?0～100瓦電燈或日光燈），需1500～3000勒克斯/厘米2。

3）溫度?適溫一般在10～30℃之間，最適溫常為20～25℃。若在室外培養(yǎng)，夏季中午高溫，冬季早晚低溫，常造成不利影響，需設(shè)法調(diào)節(jié)。

4）無機營養(yǎng)?應(yīng)不斷添加新鮮培養(yǎng)液，及時補充被藻吸收后減少了的某些元素。

5）注意pH變化?如變動過大，可用酸、堿調(diào)節(jié)。

6）適當(dāng)控制培養(yǎng)物中藻細胞濃度?過高會引起光照和無機營養(yǎng)不足，并導(dǎo)致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范圍內(nèi)。

7）及時觀察和檢查藻類生長情況?可以通過培養(yǎng)物呈現(xiàn)的顏色、藻類細胞運動情況、是否有沉淀附壁、菌膜及敵害生物污染跡象等觀察而了解一般的生長情況。藻種和中繼培養(yǎng)每半月進行一次全面顯微鏡檢查。大量培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有不正?，F(xiàn)象，應(yīng)立即鏡檢，目的有兩個：了解藻細胞生長情況，并檢查有無敵害生物污染。

（3）采收：培養(yǎng)液中藻體的適時采收，既是培養(yǎng)的目的，也是繼續(xù)培養(yǎng)的手段。因為通過采收一部分藻體，可使藻細胞濃度保持恒定。通常在培養(yǎng)物細胞濃度達到干重0.4～0.5克/升時，即可采收培養(yǎng)總量1/3的藻體。

采收時，先攪拌培養(yǎng)物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明礬或6％飽和石灰水。約1～2小時，藻細胞即可完全沉淀，取出沉淀，離心、濃縮、烘干。在大型培養(yǎng)池中采收藻體，可另外設(shè)計適當(dāng)?shù)墓に嚵鞒獭?/span>